本发明公开了一种筛选肿瘤化疗增敏剂的方法,包括以下步骤:a)让候选化合物和细胞接触;b)加入线状病毒(Filoviridae)感染细胞;c)测量线状病毒对细胞的感染。本发明利用候选化合物直接抑制多药抗药性(multidrug resistance,MDR)相关的运输通道蛋白的活性时,也同时会抑制病毒的入侵的特点,选取化合物对病毒入侵的抑制为指标来筛选肿瘤化疗药物增敏剂,这种基于病毒感染的药物筛选方法,简单(以病毒感染为参数),快速(10小时后,可以得到结果),高通量(每天可以完成1-5万化合物的筛选)。
1.一种检测化合物MDR1抑制活性的方法,其特征在于,包括以下步骤:a)让化合物和细胞接触,所述的细胞是Vero-E6或293T细胞;b)加入线状病毒(Filoviridae)假病毒感染细胞,所述的线状病毒是埃博拉病毒(Ebolavirus)和/或马尔堡病毒(Marburgvirus);c)测量线状病毒对细胞的感染。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的假病毒的衣壳蛋白中包含有荧光素酶或者荧光蛋白。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤c)所述的测量线状病毒对细胞的感染的方法通过测量重组假病毒表达的荧光素酶或者荧光蛋白的荧光强度来表征病毒对细胞的感染。技术领域
本发明属于生物医药领域,特别涉及一种筛选肿瘤化疗增敏剂的方法。
背景技术
肿瘤化疗失败,90%以上的原因是肿瘤细胞对肿瘤药物产生了抗性而导致的,也就是肿瘤细胞的多药抗药性((multidrugxa0resistance,MDR))。决定肿瘤抗药性的因素有多种可能,其中最重要的是肿瘤细胞会把药物快速地运出细胞,使药物在肿瘤细胞质中的滞留时间缩短,大大降低药物的作用效果。承担药物运输的主要元件就是各种运输通道蛋白(transporter),包括向细胞内(uptake)和向细胞外(efflux)运输的两类运输通道蛋白。前者把抗肿瘤药物运进细胞,后者把药物运出细胞。研究发现,肿瘤干细胞通过大量表达将药物运出的运输蛋白(ABC运输蛋白,ATP-bindingxa0cassette运输蛋白)的方式,来降低细胞内药物的有效浓度,从而产生抗药性。因此ABC运输蛋白是新的药物靶点。这类蛋白有48个成员,其中对MDR1、MPR1和BCRP的研究显示,这三个蛋白的过量表达和癌细胞的抗药性紧密相关,是肿瘤抗药现象最常见的机制。这些发现,为癌症治疗药物的研发提供了一个新的方向:抑制MDR1、MPR1和BCRP等通道蛋白的活力,使化疗药物可以滞留在肿瘤细胞内,提高肿瘤细胞对药物的敏感性、逆转肿瘤细胞的抗药性。总体说来,提高化疗药物的疗效,降低其毒副反应是根治肿瘤的重要措施。因此,低毒高效的化疗增敏剂具有广泛的应用前景,加快化疗增敏剂的开发和研究将会为肿瘤治愈带来新的希望。目前筛选针对运输蛋白的化疗增敏剂的方法,主要采用的是实验筛选的方案。MDR1、MPR1和BCRP是最重要化疗增敏剂类药物靶点,它们都是多次跨膜结构,功能和三维结构都很复杂。基于结构的虚拟药物筛选不适用于这类蛋白,所以主要采用的是实验筛选的方案。目前的实验筛选都采用了一个基本的原则:当候选化合物抑制了MDR1等蛋白的活力,那么抗肿瘤药物可以在更低的浓度或者更短的时间里杀死肿瘤细胞。所以采取的是直接观察肿瘤细胞死亡过程,来评价候选化合物的效果。基本程序是先分离、培养MDR1等蛋白过量表达的肿瘤细胞,加入抗肿瘤药物,同时加入候选化合物,如果MDR1等目标蛋白对候选化合物敏感、活力降低或丧失,那么可以观察到肿瘤细胞的死亡;作为对照,不加入化合物或者加入对MDR1等目标蛋白无作用的化合物,同样浓度下抗肿瘤药物不会杀死肿瘤细胞。类似的方案已经沿用多年,但是这些方法都存在缺陷:1)需要培养肿瘤细胞来针对性筛选;2)观察肿瘤细胞死亡耗费时间和精力;3)无法选取指标或参数来实现大规模筛选。这几个缺陷,导致针对MDR1等靶点蛋白的药物研发进展缓慢,至今还没有一个相关药物由FDA批准进入临床应用阶段。要克服这些缺陷,需要新的方案来实现大通量筛选,从海量的化合物库中找到好的候选化合物。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题就是针对传统的筛选化疗增敏剂的方法存在耗时、费精力、难以大规模筛选的缺陷,提供一种更简单、明了、易于实现大通量筛选的新的筛选化疗增敏剂的方法。本发明提供一种筛选肿瘤化疗增敏剂的方法,包括以下步骤:a)让候选化合物和细胞接触;b)加入线状病毒(Filoviridae)感染细胞;c)测量线状病毒对细胞的感染。本发明中,步骤a)所述的细胞优选表达来源于灵长类MDR1的细胞。本发明中,步骤a)所述的候选化合物较佳的是现有的组合化合物库或者天然产物库,如从中草药中提取和分离天然化合物库。本发明中,步骤b)所述的线状病毒(Filoviridae),优选埃博拉病毒(ZaireEbolavirus请给出拉丁名)和/或马尔堡病毒(Marburgvirus)。本发明中,步骤b)所述的病毒优选假病毒。较佳的,假病毒的衣壳蛋白(ENV)来自线状病毒属(Filoviridae),基因组中包含有报告基因。所述的报告基因可以是本领域常规的报告基因,优选荧光素酶或者荧光蛋白的编码基因。本发明中,步骤c)所述的测量线状病毒对细胞的感染的方法是本领域的常规方法,较佳的,通过测量重组假病毒表达的荧光素酶的活力或者荧光蛋白的荧光强度来表征病毒对细胞的感染。本发明所述的方法优选所有加样过程由机械臂完成的高通量的方法,可以实现高通量、大规模的筛选。本发明的方法筛选到的化合物抑制线状病毒的感染细胞,同时这些化合物也是肿瘤化疗增敏剂/或ABC运输蛋白抑制剂。本发明中,所述的“肿瘤化疗增敏剂”是指促进化疗药物滞留在肿瘤细胞内,提高肿瘤细胞对药物的敏感性,逆转肿瘤细胞的抗药性的药物。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外,均市售可得。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。图1是MDR1的表达水平降低对线状病毒感染力的影响。图2是肿瘤细胞中MDR1的表达水平和线状病毒感染力之间的关系。其中,2A是MCF7细胞;2B是MDA-MB-231细胞。图3是MDR1的抑制剂对线状病毒感染力的影响。其中,3A是3.5μMcompoundxa0C对线状病毒感染力的影响;3B是75μMxa0Verapamil对线状病毒感染力的影响;3C是20μMxa0cyclosporinA对线状病毒感染力的影响。
具体实施方式
本发明人经过仔细研究和反复试验,惊喜的发现化合物直接抑制MDR(多药抗药性,multidrugxa0resistance)相关蛋白的活性时,也同时抑制线状病毒的入侵。因此,本发明人利用这种相关性,选取化合物对病毒入侵的抑制作用为指标来筛选肿瘤化疗增敏剂,经过反复试验论证,终于得到了一种简单、能够实现高通量的筛选肿瘤化疗药物增敏剂的方法,从而完成了本发明。一、线状病毒入侵过程和MDR具有相关性本发明人发现,在线状病毒侵入的多种细胞中,包括来自狗、猪、啮齿和灵长类等的细胞,当MDR1蛋白的活性受到抑制或者在细胞中的数量减少,线状病毒入侵该细胞的能力也会相应地下降。一个例子是在人源细胞293T的感染实验中,当用shRNA来降低MDR1的表达后,埃博拉病毒和马尔堡病毒对细胞的入侵能力都明显下降,见图1。另外一个突出的例子是采用MDR1表达或活性缺陷的细胞系,MCF7和MDA-MB-231。该两株细胞有个共同点:是MDR1表达很低的乳腺癌细胞系,对肿瘤化疗药物阿霉素敏感。实验证实,埃博拉病毒和马尔堡病毒不能很好的入侵这两株细胞;然而在外源引入MDR1的表达后,两株细胞对阿霉素敏感度下降,与此同时,埃博拉病毒和马尔堡病毒对细胞的入侵能力也大幅度上升(见图2A、2B,和表1)。在这两个例子中,作为对照,MDR1蛋白活性的变化并不会明显影响到其他病毒,如VSV和LCMV对细胞的入侵能力(见图1、2)。因此,线状病毒入侵细胞过程和MDR1的活性间存在相关性。二、线状病毒的感染能力和MDR1的表达及活力密切相关本发明人选取了多个经证实的MDR1抑制剂,包括compoundxa0C、Verapamil和cyclosporinA均成功抑制了线状病毒对细胞的感染,但是阴性对照病毒VSV,LCMV不受影响(见图3)。因此,线状病毒的感染能力和MDR1的表达及活力密切相关,表明线状病毒对细胞侵染力的变化可以作为筛选MDR1等蛋白抑制剂的表观指标。三、利用线状病毒对细胞侵染力的变化来筛选肿瘤化疗增敏剂的方法本发明以线状病毒对细胞侵染力的变化作为表观指标,筛选MDR1等蛋白抑制剂,包括以下步骤:a)培养细胞;b)让候选化合物和细胞接触;c)加入病毒液,让病毒感染细胞;d)测量病毒对细胞的感染。本发明中,所述的病毒为线状病毒,优选埃博拉病毒和/或马尔堡病毒。线状病毒属是负链RNA病毒,侵染灵长动物。未经改造的线状病毒会引起病毒性出血热,但是为了研究这类病毒的入侵过程,可以只取出该类病毒衣壳蛋白的编码基因,和去除本身衣壳蛋白的其他病毒的编码基因共同在宿主中表达,从而得到不具有传染能力的假病毒。这种重新包装得到的假病毒,在病毒的外部结构上只保留了作为研究对象的衣壳蛋白,没有复制和传染能力,可以在普通实验室里操作使用。因此,本发明中所述的病毒优选假病毒。本发明中,包装好的假病毒较佳的带有荧光素酶或者荧光蛋白基因,在完成入侵细胞后,携带的荧光素酶或者荧光蛋白基因在细胞中表达,可以在10-15小时后通过荧光信号自动检测和计算出病毒侵染的能力。通过测量酶或蛋白的荧光强度来表征化合物对病毒入侵细胞的抑制,利用这种抑制作用来反映这种化合物作为肿瘤化疗药物增敏剂的潜力。剔除假阳性后即得到有真实效果的候选化合物。传统的筛选MDR1等蛋白抑制剂的方案,采用直接观察的方法。在实验流程上,往MDR1过量表达的肿瘤细胞培养液中,同时加入抗肿瘤药物和候选的抑制MDR1活力的化合物。在药物作用20-150小时后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定药物的细胞毒性、计算耐药倍数和逆转倍数等。该方法需要长时间观察肿瘤细胞的生长状态,监测细胞生长曲线的方法耗费时间、人力和物力,无法实现高通量,而且假阳性率高、确认程序繁琐;更重要的是当面对一个10万级的化合物库时,采用这种传统方案,资源消耗会呈指数增加,代价非常高昂,所以只能在实验室或者小规模水平的筛选中应用。本发明和传统方法相比较而言,1)不需要培养特定的肿瘤细胞;2)不需要加入抗肿瘤药物,只需要加入候选的MDR1抑制剂;3)不需要杀死细胞,如果候选化合物有细胞毒性,可以直接被淘汰;4)不需要长时间观察,8-10小时后可以看结果;5)最重要的是,由于病毒入侵药物筛选已经实现自动化,利用自动加样臂系统,采用这种流程,每天可以完成1-5万化合物的筛选。细胞生长状态观察和病毒感染力检测,这两种方法的比较在表中列出(见表2)。表1.MDR1的表达水平、肿瘤细胞对药物的敏感性和线状病毒感染力之间的关系ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表2.本发明和传统方法的比较ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>下面用实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例1假病毒的包装和纯化步骤参照文献:Takadaxa0A,Robisonxa0C,Gotoxa0H,Sanchezxa0A,Murtixa0KG,etxa0a1.(1997)Axa0systemxa0forxa0functionalxa0analysisxa0ofxa0Ebolaxa0virusxa0glycoprotein.Procxa0NatlAcadxa0Scixa0USAxa094:14764-14769。但是在制备用于高通量筛选的线状病毒时,VSV(水疱性口炎病毒)的基因组中的衣壳蛋白用荧光素酶来替代。用AvrII和SpeI(Newxa0Englandxa0Lab)酶切pVSV-ΔG(参考上述文献),胶回收11kb片段后,和荧光素酶基因(取自pGL4,Promega)连接,取200ng连接产物转化感受态细胞(Onexa0Shotxa0DH5α来自Invitrogen),测序鉴定阳性克隆,得到的克隆为pVSV-ΔG-luc。以下实验步骤都参照上述文献,所用到的试剂除非特别说明的,均同于文献所述,具体包括:1)293T细胞(ATCC目录号CRL-11268)培养在DMEM中(10%的invitrogenxa0FBS),用编码T7RNA聚合酶的腺病毒vTF7-3(Fuerst,T.R.,Niles,E.G.,Studier,F.W.&xa0Moss,B.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USAxa083,8122-8126)感染293T细胞。2)37°C温浴1小时后,用质粒pVSV-ΔG-Luc、NP、POL、VSVG(见文献Takadaxa0A,Robisonxa0C,Gotoxa0H,Sanchezxa0A,Murtixa0KG,etxa0al.(1997)Procxa0Natlxa0Acadxa0Scixa0USA94:14764-14769)共转染293T细胞,48小时后收集的上清病毒液为VSV-ΔG*G。3)为了包装线状病毒的衣壳蛋白,先用编码衣壳蛋白的质粒pEbola-ZGPΔm、pMarburg-GP、VSVG或者pCAGGS-LCMVGPC(前三个表达质粒同于文献所述:Shimojimaxa0M,Takadaxa0A,Ebiharaxa0H,etxa0al.(2006)Tyro3family-mediatedxa0cellxa0entryxa0ofxa0Ebolaxa0andxa0Marburgxa0viruses.Jxa0Virol:80:10109-16.pCAGGS-LCMVGPC的表达质粒同于文献所述:Beyer,W.R.,Popplau,D.,Garten,W.,vonxa0Laer,D.&xa0Lenz,O.(2003).Endoproteolyticxa0processingxa0ofxa0thelymphocyticxa0choriomeningitisxa0virusxa0glycoproteinxa0byxa0thexa0subtilasexa0SKI-1/S1P.JVirolxa077,2866-2872)转染293T细胞,30小时后,用步骤2)中收集的VSV-ΔG*G感染该细胞,在37°C温浴1小时后,用PBS洗去残留的病毒,再过36小时后收集的病毒就是带有线状病毒衣壳蛋白的假病毒。所得病毒再经0.2uM的滤膜过滤(millipore),然后经过两次超速离心,即一次用BeckmanSW28转头(20Kxa0rpm,1小时)对15%的蔗糖离心,另一次用Beckmanxa0SW55转头(40Kxa0rpm,1小时)离心,得到的病毒沉淀用TNE(10mMxa0Tris,100mMNaCl,1mMxa0EDTA)悬浮,充分打散后,分装保存在-80°C。实施例2xa0MDR1的表达对病毒感染力的影响首先制备用降低MDR1表达的的逆转录病毒液,293T细胞按1∶3的数量稀释后,在37°C培养过夜,用编码MDR1xa0shRNA序列载体(sigma目录号TRCN0000059684)和pCMV-VSVG、pDeltaxa08.9(均来自sigma)共转染细胞,48和72小时后收集病毒液,0.2uM滤膜过滤后备用。293T细胞按1∶4分在6孔板中,培养在DMEM里(10%的invitrogenxa0FBS),37°C培养过夜后,用制备的含有MDR1xa0shRNA序列载体制备的逆转录病毒液(参照Sigma操作手册)感染该293T细胞(M.O.I.即multiplicityxa0ofxa0infection为10)。对照为含空载体的病毒(即pLKO.1,来自sigma)。30小时后,用Puromycin来筛选阳性细胞。在细胞传代5次后,细胞分在96孔板中,37°C过夜培养后,往细胞中加入实施例1中制备的病毒来感染细胞,15小时后,用荧光素酶分析试剂盒(购自Promega,Luciferasexa0Assayxa0Systemxa0withxa0Reporterxa0Lysisxa0Buffer)来测量荧光素酶的活力。结果见图1。用pCDNA-MDR1(参照文献Dingxa0S,Chamberlainxa0M,Mclarenxa0A,etxa0al.(2001)Cross-talkxa0betweenxa0signallingxa0pathwaysxa0andxa0thexa0multidrugxa0resistantxa0proteinMDR-1.Br.J.Cancer;85:1175-1184.)或空质粒pCDNA(Invitrogen)转化MCF7细胞(ATCC目录号HTB-22或MDA-MB-231细胞(ATCC目录号HTB-26D),30小时后,把细胞分在96孔板里,37°C过夜培养后,用实施例1中制备的病毒来感染细胞。15小时后,测量荧光素酶的活力。结果见图2A、2B和表1。实施例3xa0MDR1的抑制剂对病毒感染力的影响将Vero-E6细胞(订购自ATCC,目录号CRL-1586)分在96孔板中,培养在DMEM里(10%的invitrogenxa0FBS),37°C培养过夜。先加入MDR1的抑制剂(3.5μMxa0compoundxa0C、75μMxa0Verapamil或20μMxa0cyclosporinA),37°C放置10分钟后,用实施例1制备的病毒来感染细胞,15小时后测量荧光素酶的活力。结果见图3。实施例4肿瘤化疗增敏剂高通量筛选过程参照实施例3,但是所有加样的过程由机械臂完成(Perkinxa0ElmerJanusxa0Workstation),Vero-E6细胞分在96孔板中,培养在DMEM里(10%的invitrogenxa0FBS),37°C培养过夜。从候选化合物库里取样,依次加入Vero-E6细胞的培养液中,放置10-30分钟后,用实施例1制备的病毒来感染细胞。15小时后测量荧光素酶的活力。